(5)雜交瘤細胞培養與抗體的农药分離取篩選出的陽性雜交瘤細胞在CO2培養箱中進行體外培養，從培養液中分離單克隆抗體。残留或選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，酶的免先用4-甲基十五烷或液體石蠟進行腹腔注射，活性1周後將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中。抑制疫分接種1周後收集小鼠的免疫腹水，分離腹水中的分析單克隆抗體。
3、技术抗體純化單克隆抗體的析法純化方法與多克隆抗體的純化方法類似。目前最有效的农药單克隆抗體的純化方法是免疫親和色譜法，該法將葡萄球菌A蛋白或抗小鼠免疫球蛋白與適當載體(最常用的残留是Sepharose)交聯，製備免疫親和色譜柱，酶的免將抗體結合後洗脫，活性回收率可達90％以上。抑制疫分
半抗原、抗原和抗體的標記根據所選的標記免疫分析方法不同，選用不同的標記物。如酶聯免疫吸附測定法(ELISA)常用的標記物有辣根過氧化物酶(horseradish Deroxidase，HRP)、堿性磷酸酯酶(alkaline phosptlatase，AP)等，流動注射免疫分析(FIIA)常用的標記有魯米諾等，(ABS)係統所用的標記物為生物素，金標免疫分析所用的標記物是納米金。
半抗原的標記依標記物的種類和半抗原的活性基團不同采用不同標記方法。如用辣根過氧化物酶標記含遊離羧基的半抗原，通常采用碳二亞胺法、活性酯法或混合酸酐法。用辣根過氧化物酶標記含有遊離氨基的半抗原可采用戊二醛法、二異硫氰酸酯法等。需要注意的是，辣根過氧化物酶催化過氧化物釋放活性氧，一些化學性質不夠穩定、容易被氧化的半抗原(如酚類化合物等)在與辣根過氧化物酶共價耦聯的過程中要注意避光避氧，防止半抗原被氧化後導致相應抗體無法識別。
酶標半抗原的純化可采用透析、超濾離心法。小分子標記物標記的半抗原可采用薄層色譜、柱色譜法分離純化。
抗原的標記視抗原的種類和特性而定。在農藥免疫分析中，所用的抗原是人工合成的(半抗原與載體蛋白的耦聯物)，因此標記物可以標記在人工抗原的載體蛋白上。蛋白質類抗原的標記、純化，與抗體的標記、純化方法類似。
抗體的標記根據標記物的不同采用不同的標記方法。辣根過氧化物酶標記抗體常采用改良的過碘酸鹽法，即將辣根過氧化物酶分子中糖的醇羥基氧化成醛基後與抗體的遊離氨基共價耦聯。分子中含遊離羧基(如生物素等)、遊離氨基的標記物(如辣根過氧化物酶)與抗體的耦聯方法類似於含遊離羧基、氨基的半抗原與載體蛋白的共價耦聯。含芳香族伯胺的標記物，采用重氮化法與抗體分子中酪氨酸殘基的酚羥基鄰位形成偶氮鍵連接。含異氰酸酯結構的標記物可與抗體的遊離氨基直接耦聯。為防止標記物耦聯在抗體的抗原結合部位而導致抗體的免疫學活性降低，可采用馬來酰亞胺類活性酯等方法將標記物與單鏈抗體的巰基共價連接，因為抗體的抗原結合部位不含巰基。納米金標記抗體則采用物理吸附法。
由於標記物的分子大小不同，標記抗體的純化方法也不同。如標記物為小分子化合物，標記抗體的純化可采用透析、離心超濾法。若標記物為大分子(如辣根過氧化物酶)，標記抗體的純化通常采用Sephadex凝膠柱色譜法。如用小分子標記物標記半抗原，可采用薄層色譜、矽膠柱色譜法分離純化。
抗原抗體反應中，抗體的濃度需與抗原濃度相適應，通常采用方陣實驗法篩選抗原抗體的最適濃度組合。
(1)間接競爭酶聯免疫吸附測定法中包被原和抗體濃度的選擇，對於問接競爭酶聯免疫吸附測定法，包被原和抗體濃度的選擇步驟如下。
①包被：將包被原用pH 9.6的碳酸鹽緩衝液倍比稀釋成一定的濃度係列，100μL/孔，包被酶標板不同的行，空白對照孔加等體積緩衝液，4℃下吸附過夜。
②封閉：次日傾去包被液，洗滌去除遊離物，加封閉液150μL/孔，37℃下封閉1.5 h。洗滌去除遊離物。
③反應：將抗體用適當pH的磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer，PB)倍比稀釋至一定濃度係列加入酶標板的不同列，100μL/孔，37℃下反應1～1.5 h。洗滌去除遊離物。
④加酶標二抗：將酶標二抗稀釋至工作濃度，加至酶標板，100μL/TL，37℃下反應1～1.5 h。洗滌去除遊離物。
⑤顯色測定：加底物與顯色劑混合液100μL/孔，37℃下避光反應15 min。加50μL/孔終止劑終止反應，在酶標儀上測定各孔的吸光值。
分別以包被原濃度和抗體濃度為橫坐標、以吸光值為縱坐標作圖。選擇吸光值約為1.0抗原和抗體濃度都較低、處於吸光曲線拐點處的抗原和抗體濃度為最適濃度組合。
(2)包被抗原直接競爭酶聯免疫吸附測定法中包被原和酶標抗體濃度的選擇在包被抗原直接競爭酶聯免疫吸附測定法中，包被原和酶標抗體濃度的選擇步驟如下。
①包被：將包被原用pH 9.6的碳酸鹽緩衝液倍比稀釋成一定的濃度係列，包被酶標板的不同行，100μL/TL，空白對照孔加等體積緩衝液，4℃下吸附過夜。
⑦封閉：次日傾去包被液，洗滌去除遊離物，加封閉液150μL/TL，37℃下封閉1.5 h。洗滌去除遊離物。
③反應：將酶標抗體倍比稀釋成工作濃度係列，加至酶標板的不同列，100μL/孔，37℃下反應1～1.5h。洗滌去除遊離物。
④顯色測定：加底物與顯色劑混合液100μL/孔，37℃下避光反應15min，加終止劑50μL/孔終止反應，在酶標儀上測定各孔的吸光值。
分別以包被原濃度和酶標抗體濃度為橫坐標、以吸光值為縱坐標作圖。選擇吸光值約為1.0處於吸光曲線拐點處的包被原和酶標抗體濃度為最適濃度組合。
(3)包被抗體直接競爭酶聯免疫吸附測定法中抗體和酶標半抗原濃度的選擇在包被抗體直接競爭酶聯免疫吸附測定法中，抗體和酶標半抗原濃度的選擇步驟如下。
①包被：將抗體用適當pH的磷酸鹽緩衝液倍比稀釋成一定的濃度係列並包被酶標板的不同行，100μL/TL，空白對照孔加等體積磷酸鹽緩衝液，4℃下吸附過夜。
②封閉：次日傾去包被液，洗滌去除遊離物，加封閉液150 μL/TL，37℃下封閉1.5 h。洗滌去除遊離物。
③反應：將酶標半抗原用磷酸鹽緩衝液倍比稀釋成一定濃度係列並加至酶標板的不同列，100μL/TL，37℃下反應1～1.5 h。洗滌去除遊離物。
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