微生物的维氏生長繁殖和代謝是導致食品腐敗變質的重要因素。細菌群體感應（QuorumSenSIng，气单群体取物QS）是胞菌一種依賴於細胞密度的信息交流方式，以自誘導物（AuToInducerS，中介AIS）為群體感應信號分子，导的的干它通過調控食品中優勢腐敗菌的现象生長代謝來調控食品腐敗進程。研究表明，蒜提群體感應抑製劑可通過與AIS受體蛋白結合，扰作降解AIS分子和阻斷群體感應通路等途徑有效幹擾細菌群體感應的维氏表達，降低食源性細菌的气单群体取物致病性或致腐性。利用群體感應抑製劑靶向調控細菌的胞菌群體感應係統來抑製食品腐敗，已成為食品保鮮領域的中介研究熱點之一。
近年來，导的的干研究學者在水果、现象蔬菜和中草藥等天然植物的蒜提提取物中篩選到很多安全、有效的活性成分，這些物質作為群體感應抑製劑可有效降低微生物的毒性。大蒜提取物是具有群體感應抑製活性的物質，能在亞抑菌濃度下阻斷N-酰基高絲氨酸內酯（AHLS）信號分子介導的群體感應係統，抑製其毒力因子產生，然而，目前關於大蒜提取物對腐敗菌腐敗能力的幹擾作用仍少有報道。
本試驗以在發酵魚糜中篩選到的腐敗菌維氏氣單胞菌為對象，分析其AHLS介導的群體感應現象，探究大蒜提取物對該細菌產AHLS活性、生物膜形成能力、毒力基因表達和致腐能力的幹擾作用，以期利用大蒜提取物等群體感應抑製劑作為食品保鮮劑，提高食品的安全性和貨架期。
材料：新鮮大蒜，購於杭州市潮王路菜市場；魚糜，A級海產銅盆魚糜，由上虞市傣之味食品有限公司提供，貯藏於-18℃冰箱中，備用。菌種：維氏氣單胞菌，分離於發酵魚糜，添加20%甘油，保存於本實驗室-80℃冰箱中。根癌農杆菌[AgrobActeriumtumefAeiensA136（PcF218/PcF372）]，壯觀黴素抗性，用量為50μg/mL。
試劑：甲酸、乙酸乙酯、二甲基亞碸（DmSO）、甲苯為分析純級，國藥集團化學試劑有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、結晶紫、吖啶橙、壯觀黴素、細菌基因組DnA快速抽提試劑盒、細菌總RnA快速抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；RP-c18F254S反相薄層層析板，德國merck公司；AHLS標準品，美國SIgma公司。
1.2儀器與設備
SPecTramaxm5酶標儀，美國molecularDevIceS公司；LIFeEcoPcR儀，杭州博日科技有限公司；FV300激光共聚焦顯微鏡，日本OLYmPUS公司；STePOne型熒光定量PcR儀，美國ABI公司；PHS-3c型數顯酸度計，上海精科儀器有限公司；K9840自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；e2695型高效液相色譜儀，美國WaTerS公司；YXQ-LS-SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。
參照Ravn等的方法，采用生物報告菌法分析細菌產AHLS分子的活性和種類。
采用平行劃線法分析AHLS的產生情況，在含1%瓊脂的LB平板上塗布40μLX-gal（20mg/mL），將活化12h的根癌農杆菌與待測菌平行劃線，於30℃中培養24h，觀察根癌農杆菌的顏色變化。
將待測菌培養液離心（8000×g，5mIn，4℃），上清液用等量酸化乙酸乙酯（0.5%甲酸）提取2～3次，合並有機相，旋轉蒸發儀蒸幹溶劑，用DmSO重新溶解，於-20℃保存待用。
采用平板擴散法分析AHLS活性變化，100mL含1%瓊脂的LB培養基中加入4～10mL活化的根癌農杆菌和500μLX-gal（20mg/mL），混合均勻後傾注平板，待冷卻凝固後打孔，加入40μL待測菌AHLS提取液，於30℃中培養36～48h，觀察平板的顏色變化。
采用薄層色譜法（TLc）分析細菌產生AHLS種類，取1～10μLAHLS標準品與細菌AHLS提取物樣品，點樣於c18反相薄層層析板。用層析液甲醇-水（體積比60/40）充分展開，取出後在常溫下揮幹溶劑。製備含根癌農杆菌的固體培養基，傾於板上，凝固後在30℃無菌密閉容器中培養36～48h，觀察顏色變化。AHLS標準品的濃度分別為：0.1mmol/LN-丁酰基-高絲氨酸內酯（c4-HSL）、10μmol/LN-己酰基-高絲氨酸內酯（c6-HSL）、0.04μmol/LN-庚酰基-高絲氨酸內酯（c7-HSL）、0.06μmol/LN-辛酰基-高絲氨酸內酯（c8-HSL）、0.8nmol/L3-氧代-己酰基-高絲氨酸內酯（oxo-c6-HSL）和1.6nmol/L3-氧代-辛酰基-高絲氨酸內酯（oxo-c8-HSL）。
將活化12h的待測菌接種到100mLLB液體培養基中，在30℃下搖床培養24h，間隔一定時間取樣，參照GB/T4789.2-2008《食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》計數，同時利用酸度計測定培養液PH值的變化。
采用PcR技術分析細菌的luxRI同源基因、鳥氨酸脫羧酶基因（ODC）、賴氨酸脫羧酶基因（LDC）、鞭毛基因（flA）、彈性蛋白酶（AhyB）、絲氨酸蛋白酶基因（ser）、脂肪酶基因（liP）。將細菌過夜活化，利用細菌DnA提取試劑盒提取細菌DnA模板，使用的引物見表1。50μL反應體係，PcR擴增程序為：預變性95℃3mIn，變性95℃30S，退火55℃1mIn，延伸72℃1mIn（35個循環），終延伸72℃10mIn。其中，擴增AhyB和flA基因時退火溫度為59℃。將擴增到的基因片段進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下成像，同時送往生工生物工程有限公司測序。將得到的序列進行BLAST搜索和同源性分析。
參照RaSmuSSen等的方法製備大蒜提取物。將市售大蒜去皮，稱取150g於300mL甲苯中勻漿，萃取12h後用WhaTman1號濾紙過濾。向濾液中加入150mL無菌水，在室溫條件下攪拌24h，兩相分離得水相，經0.22μm濾膜過濾後得1g/mL大蒜提取物。通過二倍稀釋法確定大蒜提取物對待測菌的最小抑菌濃度。
將待測菌過夜活化12h，取500μL細菌培養液接種至100mLLB液體培養基中，分別加入1mL不同質量濃度的大蒜提取物（終質量濃度為0.15～1.20mg/mL），以無菌生理鹽水為對照，於30℃搖床中振蕩培養12h，將培養液離心（8000×g，10mIn）得上清液。參照mIller的方法測定生物報告菌的β-半乳糖酶活性。
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