黑果腺肋花楸又名不老莓、高效果腺野櫻莓，液相氧化屬薔薇科植物。色谱素營養豐富，法测果實中富含花青素、定黑多酚以及黃酮等多種功能成分，肋花具有抗炎、楸提取物抗輻射、中氯降血糖、化矢含量保肝等功效，车菊同時還可以清除機體自由基。及抗究果實既可生食，性研亦可加工製作保健飲料、高效果腺果汁、液相氧化果酒和果醬等食品，色谱素具有健脾理氣、益氣止咳的作用。目前國內外對黑果腺肋花楸的研究極少，開發和利用其功能成分對以後的研究極其重要。
花色苷是一類廣泛存在於植物體內的水溶性的黃酮類天然色素，是由花青素與各種糖類形成的糖苷。其中95％的花色苷中均含有六種花青素，即天竺葵色素、矢車菊素、飛燕草色素、芍藥色素、牽牛花色素和錦葵色素，通過強酸水解可將花青素轉化成6種常見花色素中的一種或幾種。花青素具有較強的抗氧化性，能夠清除人體內的自由基，抑製肝脂質的過氧化現象，並呈現一定的量效關係，能夠阻止活性氧對DNA、蛋白質、脂質和其他生物大分子的損害，清除有害的自由基，因此具有預防心血管疾病，預防癌症，緩解糖尿病，保護眼睛等功效，現在已經被應用到食品、藥品、保健品、化妝品等中。目前，尚未見關於黑果腺肋花楸提取物中氯化矢車菊素含量測定的報道。本文參照相關文獻，供試品溶液製備采用加熱回流酸化甲醇水解法，該工藝成熟且簡單易於操作。采用HPLC法測定黑果腺肋花楸提取物中氯化矢車菊素的含量，為黑果腺肋花楸果的進一步開發應用提供試驗依據。
一、材料與方法
1、材料與試劑
黑果腺肋花楸提取物(吉林化工學院化學與製藥工程學院實驗室自製)；氯化矢車菊素(對照品，HPLC≥98％，成都曼思特生物科技有限公司)；甲醇、磷酸(色譜純，天津市大茂化學試劑公司)；水為重蒸餾水；其餘所用試劑均為國產分析純。
2、儀器與設備
LC-2000型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；W5-100SP型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；FA-2004N型電子分析天平(上海精密科學儀有限公司)；KQ250DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TU-1950雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；T-50溶劑過濾器(天津市實驗設備有限公司)；RE-52AA隔膜真空泵(天津市津騰實驗設備有限公司)。
3、方法
（1）黑果腺肋花楸提取物中氯化矢車菊素的HPLC含量測定方法
①色譜條件色譜柱為大連依利特ODS2C18(4.6ininx250mm，5um)；流動相：A為甲醇，B為0.2％磷酸水溶液(W)，程序為0～30min，40％A；流速：0.8mL／min；柱溫：30℃；進樣量：20皿；檢測波長為276am。
②對照品溶液的製備精密稱取幹燥至恒重的氯化矢車菊素對照品1.80mg，置於50mL的容量瓶中，用2％鹽酸甲醇溶解並定容至刻度，搖勻，配製成質量濃度為0.036mg.mL-1的對照品溶液，置於冰箱中避光保存備用。
③供試樣品溶液的製備方法
稱取幹燥至恒重的黑果腺肋花楸提取物1g，放入圓底燒瓶中，加入2％的鹽酸甲醇溶液30mL，置於90℃水浴中回流1h，冷卻至室溫，搖勻，過濾，將濾液轉移至50mL容量瓶中並用2％的鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(O.22μm)濾過，取續濾液，作為供試品溶液。
④流動相的選擇
試驗中主要考察了甲醇-0.2％磷酸水溶液、乙腈-0.2％磷酸水溶液、甲醇-3％甲酸水溶液等各種流動相對黑果腺肋花楸提取物中氯化矢車菊素保留時間和分離度的影響。
⑤線性關係考察
吸取氯化矢車菊素的對照品溶液，配製成質量濃度分別為3.6、7.2、14.4、21.6、28.8、36.0μg·／mL的係列對照品溶液，分別進樣20μL，測定氯化矢車菊素的峰麵積。以吸光度氯化矢車菊素的峰麵積為縱坐標，質量濃度C為橫坐標繪製標準曲線，得回歸方程Y=37486C+3.2127，R=0.9995(n=6)。結果表明氯化矢車菊素進樣濃度在3.6～36.0μg·mL-1範圍內與峰麵積線性關係良好。
⑥重複性試驗
取同一批號黑果腺肋花楸提取物6份，稱取幹燥至恒重的黑果腺肋花楸提取物1g，放入圓底燒瓶中，加入2％的鹽酸甲醇溶液30mL，置於90℃水浴中回流1h，冷卻至室溫，搖勻，過濾，將濾液轉移至50mL容量瓶中並用2％的鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(O.22μm)濾過，取續濾液，作為供試品溶液。各進樣量20μL，測定氯化矢車菊素的峰麵積。氯化矢車菊素峰麵積分別為602.18、612.34、616.52、621.13、629.28、613.52，RSD為1.54％，結果表明含量測定方法具有較好的重複性。
⑦儀器精密度試驗
吸取對照品及供試品溶液，連續進樣6次，每次進樣20μL，分別測定對照品及供試品溶液中氯化矢車菊素的峰麵積。供試品中氯化矢車菊素峰麵積分別為624.23、623.84、631.37、645.85、623.59、611.80，RSD為1.79％。對照品中氯化矢車菊素峰麵積分別為1065.54、1140.96、1122.17、1097.34、1093.65、1138.23，RSD為2.65％，結果表明儀器精密度符合要求。
⑧供試品溶液的穩定性試驗
吸取供試品溶液，分別於0、2、4、8、12、24h進樣20μL，測定氯化矢車菊素的峰麵積。供試品中氯化矢車菊素峰麵積分別為617.32、634.17、618.97、630.15、631.22、625.34，RSD為1.09％，表明供試品溶液在室溫下24h內穩定，滿足測定要求。
⑨檢測限與定量限試驗
吸取對照品溶液適量，逐步稀釋，直到檢測峰高為基線噪聲的3倍為止，計算氯化矢車菊素的最低檢測濃度，試驗結果表明氯化矢車菊素的最低檢測限為0.360μg／mL。吸取對照品溶液適量，逐步稀釋，直到檢測峰高為基線噪聲的l0倍為止，計算氯化矢車菊素的定量限，試驗結果表明氯化矢車菊素的定量限為0.144μg／mL。
(2)供試品溶液製備方法的優化
①正交試驗
根據單因素試驗結果，基本定位了作用於花青素水解的三個要素，分別為水解溫度、反應時間和酸濃度。選擇水解溫度、反應時間、酸濃度作為考察因素，按三因素三水平進行試驗，因素水平表見表1。
②工藝驗證性試驗
稱取黑果腺肋花楸提取物3份，每份0.5g，放入圓底燒瓶中，加入3％的鹽酸甲醇溶液15mL，置於100℃水浴中回流120min，冷卻至室溫，搖勻，過濾，將濾液轉移至25mL容量瓶中並用3％的鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22μm)濾過，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。色譜柱為大連依利特ODS2C18(4.6inin×250mm，5μm)；流動相：A為甲醇，B為0.2％磷酸水溶液(V/V)，程序為0～30min，40％A；流速：0.8mL／min；柱溫：30℃；進樣量：20μL；檢測波長為276nm。分別進樣20μL，測定氯化矢車菊素的峰麵積，計算氯化矢車菊素的平均含量及RSD值，確定正交試驗所選取的水解條件的穩定性。
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